一、原理與意義

    免疫熒光組織（細(xì)胞）化學(xué)染色方法——補(bǔ)體法，是一種熒光抗體染色法。本法之熒光抗體不受免疫血清的動(dòng)物種屬的限制，因而一種熒光抗體可作更廣泛的應(yīng)用，敏感性亦較間接法高，效價(jià)低的免疫血清亦可應(yīng)用，節(jié)省免疫血清，尤其是對(duì)檢查形態(tài)小的如立克氏體、病毒顆粒等或濃度較低的抗原物質(zhì)時(shí)甚為理想。

二、操作指南

1、材料

（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補(bǔ)體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補(bǔ)體熒光抗體等，按下述的補(bǔ)體法染色。免疫血清補(bǔ)體結(jié)合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應(yīng)作1：8稀釋。

（2）補(bǔ)體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)試管法所測(cè)定的結(jié)果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

（3）抗補(bǔ)體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補(bǔ)體為2單位的條件下，用補(bǔ)體染色法測(cè)定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

2、操作步驟

（1）涂片或切片固定。

（2）吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋之免疫血清及補(bǔ)體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補(bǔ)體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內(nèi)。

（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標(biāo)本周圍水液。

（4）滴加經(jīng)過適當(dāng)稀釋之抗補(bǔ)體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

3．對(duì)照染色

（1）抗原對(duì)照。

（2）抗血清對(duì)照：用正常兔血清代替免疫血清。

（3）滅活補(bǔ)體對(duì)照：將補(bǔ)體經(jīng)56℃ 30min處理后，按補(bǔ)體同樣比例稀釋，與免疫血清等量混合后，進(jìn)行補(bǔ)體法染色。